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Studie 004)6, der Pre-exposure Prophylaxis Initiative (iPrEx)7 und Partners PrEP8 durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass PrEP auf Tenofovir-Basis die HIV-Übertragung verringern kann.Jüngste Daten aus der Praxis bestätigen einen signifikanten Rückgang der HIV-1-Inzidenz auf Bevölkerungsebene in Gebieten, in denen die PrEP-Aufnahme hoch ist9,10.Allerdings sind PrEP-Strategien, die auf häufiger Medikamentenverabreichung beruhen, durch Adhärenz begrenzt, was ihre realen Auswirkungen auf die HIV-Übertragung verringert11,12,13.Lang wirkende PrEP-Wirkstoffe können die Barrieren reduzieren, die mit der täglichen Medikamentenverabreichung, häufigen Interaktionen mit dem Gesundheitswesen und dem Stigma verbunden sind, das sexuell übertragbare Infektionen, einschließlich HIV3, umgibt.Als Teil dieses Ansatzes wurde in einer Studie des HIV Prevention Trials Network (HPTN) gezeigt, dass eine lang wirkende Formulierung des Integrase-Strangtransfer-Inhibitors Cabotegravir (CAB-LA), die alle 2 Monate subkutan injiziert wird, die HIV-Übertragung verringert ( HPTN 083)14.Das HIV-Kapsidprotein hat mehrere wesentliche Rollen in den frühen und späten Stadien des viralen Replikationszyklus, was es zu einem attraktiven Ziel für antiretrovirale Medikamente (ARVs) macht15.Lenacapavir (LEN, früher GS-6207) ist der erste klinisch validierte HIV-Capsid-Inhibitor und zeigt pikomolare antivirale Aktivität sowohl gegen Wildtypviren als auch gegen Varianten, die gegen aktuelle ARVs resistent sind16.LEN bindet an einer hoch konservierten Grenzfläche zwischen Kapsidproteinmonomeren, was zu Defekten beim Kapsidkernimport, reduzierter Virionproduktion und fehlerhafter Kapsidassemblierung führt.In einer Phase-1b-Studie wurde gezeigt, dass eine lang wirkende LEN-Formulierung eine starke antivirale Aktivität mit einer maximalen Abnahme der HIV-1-RNA von 2,3 log10 nach 9 Tagen Monotherapie17 und das Potenzial für eine zweimal jährliche subkutane Verabreichung aufweist18.GS-CA1, ein strukturelles Analogon von LEN, hat denselben kapsidabhängigen mehrstufigen Wirkungsmechanismus, ähnliche Bindungsaffinität für verschiedene Formen von HIV-Kapsid (dh Vorläufer, Monomer, Pentamer und Hexamer), ähnliche Potenz sowohl gegen HIV als auch gegen Affen-Immunschwäche Virus (SIV) und ein ähnliches Resistenzprofil.Darüber hinaus wurde zuvor gezeigt, dass es eine hohe präklinische Wirksamkeit in einem humanisierten Mausmodell der HIV-1-Behandlung aufweist (erweiterte Datentabelle 1)4.Eine langfristige prophylaktische Wirksamkeit von LEN oder GS-CA1 wurde jedoch bisher nicht nachgewiesen.In dieser Studie bewerten wir das Potenzial einer Einzeldosis eines langwirksamen Kapsidinhibitors, Schutz vor wiederholten Herausforderungen mit dem Simian-Human Immunodeficiency Virus (SHIV) bei Rhesusaffen zu bieten.GS-CA1 wurde für diese Analyse aufgrund seiner prognostizierten höheren metabolischen Clearance-Rate im Vergleich zu LEN und der damit verbundenen beschleunigten Auswaschphase nach der Dosisverabreichung ausgewählt, was eine zeitnahe Bewertung der prophylaktischen Wirksamkeit dieser Verbindungsklasse über einen weiten Bereich von Expositionen ermöglicht.GS-CA1 zeigte in vitro eine starke Anti-SHIV-Aktivität in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), die aus drei einzelnen Rhesusaffen indischen Ursprungs (Macaca mulatta) isoliert wurden, mit einer mittleren 50 % effektiven Konzentration (EC50) von 0,72 nM (Abb. 1a und erweiterte Datentabelle 2).Diese Verbindung zeigte auch einen mittleren Hill-Steigungswert von 3,0 ± 0,7 in hochdichten antiviralen Dosis-Wirkungs-Kurven, gemessen gegen den HIV-1 IIIb-Stamm in MT-4-Zellen, was eine berechnete 95 % effektive Konzentration (EC95) von 1,91 nM ergibt, wenn angewendet auf den in SHIV-infizierten Rhesus-PBMCs gemessenen EC50.Die In-vivo-Anwendung zeigte, dass ein großer Teil des subkutan verabreichten GS-CA1 durch Plasmaproteine ​​gebunden wurde, wodurch weniger freies Arzneimittel für antivirale Wirkungen zur Verfügung stand.Eine kompetitive Gleichgewichtsdialyse wurde daher verwendet, um die Rhesusplasmaproteinbindung an GS-CA1 zu berücksichtigen, was zu einer prognostizierten 15,8-fachen Abnahme der freien GS-CA1-Konzentration in vivo und zu einem Rhesusprotein-angepassten EC95 (paEC95)-Wert von 30,2 nM führte.a, Repräsentative antivirale Dosis-Wirkungs-Kurve für GS-CA1 in Rhesus-PBMCs, die akut mit SHIV-SF162P3 infiziert sind.Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung aus einem von sieben Assays (jeweils n = 3 biologische Wiederholungen) gezeigt.b, Plasma-GS-CA1-Spiegel, gemessen durch Massenspektrometrie nach einer einzelnen subkutanen Verabreichung von GS-CA1 in einer Dosis von 300 mg kg –1 bei drei männlichen Rhesusaffen und von 100 mg kg –1 bei zwei männlichen Rhesusaffen.Die untere gepunktete Linie repräsentiert die Assay-Nachweisgrenze (LOD; 1 nM).Die oberen gestrichelten Linien repräsentieren das Ein- und Sechsfache des Rhesus-paEC95 für GS-CA1 (30,2 nM bzw. 181,2 nM).Eine niedrige hepatische Clearance ist ein wesentliches Merkmal für ein lang wirkendes Mittel.Die Titration mit 3H-markiertem GS-CA1 war notwendig, um den geringen Umsatz von GS-CA1 in primären Rhesus-Hepatozyten genau zu messen, und zeigte eine vorhergesagte hepatische Clearance-Rate von 0,07 l h–1 kg–1 oder 2,9 % der hepatischen Extraktion.Diese In-vitro-Daten deuten darauf hin, dass GS-CA1 das Potenzial hat, eine Plasmaexposition mit Langzeitwirkung bei Rhesusaffen aufrechtzuerhalten.Um diese Hypothese zu testen und eine geeignete GS-CA1-Dosis für die Rhesus-Wirksamkeitsstudien auszuwählen, führten wir eine pharmakokinetische Pilotstudie mit einer einzelnen subkutanen Verabreichung einer GS-CA1-Formulierung in zwei Dosierungsstufen durch, von denen vorhergesagt wird, dass sie einen breiten Bereich von Plasmaexpositionen abdecken die voraussichtliche Dauer des Studiums.GS-CA1 wurde mit 100 mg kg–1 und 300 mg kg–1 an zwei bzw. drei naive Rhesusaffen indischer Herkunft verabreicht und ihre Konzentrationen wurden 18 Wochen lang überwacht.Die Arzneimittelspiegel im Plasma erreichten am Tag 1 nach der Dosisverabreichung einen Spitzenwert im Konzentrationsbereich von 1–3 µM, bevor sie am 7. Tag nach der Dosisverabreichung auf 0,4–1,1 µM abfielen.Danach wurden die GS-CA1-Spiegel über dem Rhesus-paEC95-Wert für mindestens 8 Wochen und 14 Wochen und über dem Sechsfachen des Rhesus-paEC95-Werts für mindestens 1 Woche und 8 Wochen für die 100 mg kg-1 und gehalten 300-mg-kg-1-Dosen (Abb. 1b).Angesichts der Tatsache, dass die mittlere angestrebte klinische Exposition von LEN für die HIV-Behandlung das Sechsfache seines paEC95 beim Menschen beträgt18, wurden GS-CA1-Dosen von 300 mg kg–1 und 150 mg kg–1 für die wiederholte SHIV-Provokationsstudie ausgewählt, um die Verringerung der Übertragung zu bewerten Risiko über Rhesus-äquivalente GS-CA1-Expositionen oberhalb, gleich und unterhalb dieser klinisch relevanten Zielkonzentration.Als nächstes führten wir eine Studie durch, um die Schutzwirkung einer einzelnen Verabreichung von GS-CA1 gegen wiederholte rektale SHIV-SF162P3-Provokationen mit eskalierender Dosis bei Rhesusaffen zu bewerten (Abb. 2a).Für diese Provokationsstudie wurden 24 Rhesusaffen indischer Herkunft in 3 Gruppen zu je 8 Affen mit ausgewogener Geschlechts- und Gewichtsverteilung eingeteilt.Alle Tiere erhielten in Woche 0 eine einzelne subkutane Verabreichung in die Schulterblattregion.Tiere in Gruppe 1 erhielten die Vehikelkontrolle, wohingegen jene in Gruppe 2 und 3 GS-CA1-Dosen von 150 mg kg –1 bzw. 300 mg kg –1 erhielten.In Übereinstimmung mit der Pilotstudie erreichte eine einzelne Verabreichung von GS-CA1 mit sowohl 150 mg kg-1 als auch 300 mg kg-1 eine lang anhaltende Exposition.Insbesondere wurden Peaks bei GS-CA1-Plasmakonzentrationen von 3,0 µM und 5,5 µM etwa 24 h bzw. 42 h nach Verabreichung der Dosis erreicht, und die GS-CA1-Spiegel nahmen danach langsam mit einer mittleren Halbwertszeit von 287–317 h ab (Abb 2b und erweiterte Datentabelle 3).Die Gruppe, die eine Dosis von 300 mg kg–1 erhielt, blieb 14–16 Wochen bzw. 5–8 Wochen lang über dem Rhesus-paEC95 und sechsmal über dem Rhesus-paEC95, während die Gruppe, die eine Dosis von 150 mg kg–1 erhielt, darüber blieb diese Zielkonzentrationen für 8–15 Wochen bzw. 3–7 Wochen.Die Varianz der pharmakokinetischen Parameter von GS-CA1 zwischen den Tieren war vergleichbar mit der, die mit 900 mg LEN beim Menschen beobachtet wurde18, während die Halbwertszeit und Dauer der Exposition über dem entsprechenden 6-fachen paEC95-Schwellenwert niedriger als erwartet waren.a, Studiendesign.Rhesusaffen indischen Ursprungs wurden in Woche 0 mit einer einzigen subkutanen Verabreichung von Vehikelkontrolle oder GS-CA1 behandelt, gefolgt von wöchentlichen intrarektalen Herausforderungen mit SHIV-SF162P3 in einem Dosiseskalationsschema, bis bestätigt wurde, dass alle Kontrolltiere in Woche 15 infiziert waren. b, Plasma-GS-CA1-Spiegel, gemessen durch Massenspektrometrie über die Zeit bei Rhesusaffen, denen einmalig 150 mg kg –1 oder 300 mg kg –1 verabreicht wurden.Die Daten für jede Gruppe sind als Mittelwert ± Standardabweichung von acht Rhesusaffen gezeigt.Die untere gepunktete Linie repräsentiert die Assay-LOD (1 nM).Die oberen gestrichelten Linien repräsentieren das Ein- und Sechsfache des Rhesus-paEC95 für GS-CA1 (30,2 nM bzw. 181,2 nM).c, Kaplan-Meier-Diagramme, die die Entwicklung einer Virämie zeigen, wie durch RT-qPCR für Plasma-SHIV-Gag bei Rhesusaffen, die mit einer einzigen subkutanen Verabreichung von Vehikelkontrolle (n = 8), GS-CA1, dosiert mit 150 mg kg–1 ( n = 8) oder GS-CA1 dosiert mit 300 mg kg−1 (n = 8).Um die schützende Wirksamkeit von GS-CA1 zu definieren, erhielten alle Tiere 15 wöchentliche intrarektale SHIV-SF162P3-Provokationen in einem Dosiseskalationsprotokoll, beginnend in Woche 1 nach der GS-CA1-Verabreichung.Die Infektion wurde durch Quantifizierung der viralen gag-RNA-Spiegel im Plasma durch quantitative PCR mit reverser Transkription (RT-qPCR) bewertet.Um die für den Schutz erforderlichen Arzneimittelspiegel zu definieren, überwachten wir die Plasmavirämie bis Woche 24, als die GS-CA1-Spiegel unter die therapeutischen Konzentrationen abfielen.Acht wöchentliche intrarektale Herausforderungen mit dem 30-fachen der mittleren Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) führten zu einer Infektion von fünf der acht mit Vehikel behandelten Tiere ( 2c , Tabelle 1 und erweiterte Daten 1 ).Eine Eskalation der Virusbelastungsdosis auf 100 TCID50 für 2 Wochen führte zu keinen zusätzlichen Infektionen, wohingegen eine weitere Eskalation auf 300 TCID50 zu einer Infektion der verbleibenden drei Kontrolltiere bis Woche 15 führte.Im Gegensatz zu der mit Vehikel behandelten Gruppe zeigte die Gruppe, die 300 mg kg-1 GS-CA1 erhielt, keine Virämie bis Woche 17 mit diesem Provokationsprotokoll mit eskalierender Dosis, als drei der acht Affen SHIV-positiv wurden (Abb. 2c, Tabelle 1 und Erweiterte Daten Abb. 1).Die anderen fünf Affen blieben bis zum Ende der Studie avirämisch, was einer Risikoreduktion von 97 % pro Exposition mit der 300-mg-kg-1-Dosis entspricht (P = 0,0001, Cox-Proportional-Hazard-Regressionsanalyse).Die Gruppe, die eine Einzelverabreichung von GS-CA1 in der reduzierten Dosis von 150 mg kg-1 erhielt, zeigte auch weniger und verzögerte Infektionen im Vergleich zu der mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe.Insbesondere wurde bis Woche 11 keine Virämie festgestellt, und zwei der acht Affen blieben bis zum Ende der Studie avirämisch, was einer Risikoreduktion von 87 % pro Exposition entspricht (p = 0,0038).Die mediane Zeit bis zur Virämie betrug 7,5 Wochen in der mit Vehikel behandelten Gruppe und 16 Wochen in der Gruppe, die 150 mg kg –1 GS-CA1 erhielt;dieser Punkt wurde in der Gruppe, die 300 mg kg-1 GS-CA1 erhielt, aufgrund einer unzureichenden Anzahl von Infektionen nicht erreicht.Die Spitzenviruslasten waren signifikant niedriger und die Viruslasten, die 7 Wochen nach der Infektion gemessen wurden, zeigten einen Trend zu niedrigeren Spiegeln bei den mit GS-CA1 behandelten Tieren im Vergleich zu den mit Vehikel behandelten Kontrolltieren.Dieses Ergebnis könnte eine verbleibende antivirale Wirkung von subtherapeutischen Inhibitorspiegeln widerspiegeln (erweiterte Daten, Abb. 2).Als nächstes führten wir immunologische Analysen bei den mit GS-CA1 behandelten Rhesusaffen durch.Zunächst untersuchten wir die Entwicklung humoraler Immunantworten gegen das Glykoprotein der SHIV-Hülle (Env) durch einen enzymgebundenen Immunadsorptionstest (ELISA).Wir stellten in Woche 24 bei allen Tieren mit SHIV-Virämie bindende Antikörperreaktionen auf Env fest, aber keine bei denen ohne SHIV-Virämie (erweiterte Daten, Fig. 3a).Zweitens bewerteten wir die Entwicklung zellulärer Immunantworten gegen das SHIV-Gag-Polyprotein durch einen enzymgebundenen Immunabsorptionsspot (ELISPOT)-Assay.Wir stellten T-Zell-Antworten auf das Gag-Protein in Woche 19 bei allen außer einem Tier mit SHIV-Virämie und bei keinem der Tiere ohne SHIV-Virämie fest (erweiterte Daten, Fig. 3b).Diese immunologischen Daten legen nahe, dass die mit GS-CA1 behandelten Tiere, die während des Studienzeitraums avirämisch blieben, tatsächlich vor einer SHIV-Provokation geschützt waren.Schließlich führten wir zusätzliche Studien durch, um zu bestätigen, dass unsere Plasma-Virämie-Messungen eine frühe Erkennung einer Erstinfektion im Rahmen der GS-CA1-Prophylaxe ermöglichten.Zuerst führten wir eine intakte provirale DNA-Analyse (IPDA) durch, um integriertes SHIV in einer Untergruppe infizierter Tiere nachzuweisen, die mit Vehikelkontrolle oder GS-CA1 mit verfügbaren PBMCs behandelt wurden.Intakte SHIV-Proviren wurden in allen Fällen zu den gleichen Zeitpunkten nachweisbar, an denen eine Plasmavirämie festgestellt wurde, mit Ausnahme eines einzelnen mit GS-CA1 behandelten Tieres (K394), das 1 Woche vor dem Nachweis der Virämie sehr geringe Mengen an intaktem Provirus zeigte (Erweiterte Datentabelle 4).Zweitens bestimmten wir die Env-ELISA-Serokonversionszeitpunkte für alle infizierten Tiere und beobachteten, dass die Virämie in allen Fällen der Serokonversion vorausging (erweiterte Datentabelle 5).Die mediane Zeit bis zur Serokonversion ab dem Einsetzen der Virämie betrug 2,5 Wochen (Bereich 1 bis 13 Wochen) bei den mit Vehikel behandelten Kontrolltieren und 4 Wochen (Bereich 1 bis 5 Wochen) bei den mit GS-CA1 behandelten Tieren, obwohl der Unterschied zwischen ihnen bestand die Gruppen waren nicht signifikant (P = 0,80, Mann-Whitney-U-Test).Als nächstes untersuchten wir die Beziehung zwischen GS-CA1-Plasmakonzentrationen und dem Schutz vor einer SHIV-Provokation.Um Expositionsvergleiche mit anderen Virostatika einschließlich LEN zu erleichtern, haben wir die Konzentrationen für GS-CA1 in Vielfache seines Rhesus-paEC95 umgerechnet.Um die Schutzniveaus für GS-CA1 abzuschätzen, konzentrierten wir uns auf sechs Tiere, die in der Gruppe, die eine Dosis von 150 mg kg–1 erhielt, eine Virämie entwickelten, und auf drei Tiere, die in der Gruppe, die eine Dosis von 300 mg kg–1 erhielt, eine Virämie entwickelten.Unter der Annahme einer zweiwöchigen Verzögerung zwischen rektaler SHIV-Infektion und nachweisbarer peripherer Blutvirämie haben wir die GS-CA1-Expositionswerte 2 Wochen vor der ersten nachweisbaren Virämie bei den infizierten Tieren gemittelt.Wir schätzten, dass eine Schleimhautinfektion in Gegenwart von durchschnittlich 31,4 nM GS-CA1 auftrat, was der Konzentration von Rhesus paEC95 mit einem Vielfachen von 1,0 entspricht (Bereich 0,4–1,6; Abb. 3a, b).Daher schätzten wir, dass insgesamt alle Tiere in diesem Modell vollständig geschützt waren, wenn die GS-CA1-Plasmakonzentrationen mehr als doppelt so hoch waren wie der Rhesus-paEC95-Wert für GS-CA1.a, Plasmaspiegel von GS-CA1, gemessen durch Massenspektrometrie bei einzelnen Rhesusaffen (n = 8), die im Laufe der Zeit mit einer Dosis von 150 mg kg –1 behandelt wurden.Schwarze Kreise stellen Zeitpunkte vor dem ersten Nachweis einer Virämie dar.Rote Kreise stellen Zeitpunkte einschließlich und nach dem ersten Nachweis einer Virämie dar.Grau schattierte Kästchen stellen Serum-Env-ELISA-Serokonversionszeitpunkte dar.Die untere gepunktete Linie repräsentiert die Assay-LOD (1 nM).Die untere und obere gestrichelte Linie repräsentieren das Ein- bzw. Zweifache des Rhesus-paEC95.b, Gleiche Daten wie in a für Rhesusaffen, die mit GS-CA1 in einer Dosis von 300 mg kg –1 behandelt wurden.Bei den acht mit Placebo behandelten Kontrolltieren wurde während der gesamten Studie kein Signal oberhalb der Assay-LOD beobachtet.Um die potenzielle Entwicklung einer Resistenz gegen GS-CA1, insbesondere während der Auswaschphase, zu bewerten, führten wir eine longitudinale Sequenzanalyse auf Populationsebene der SHIV-gag-Region durch, die das Capsid in Rhesusplasma kodiert (erweiterte Daten, Abb. 4).Wie erwartet codierte Plasmavirus, das von mit Placebo behandelten Kontrolltieren erhalten wurde, nur Wildtyp-Kapsidprotein.Von den analysierten Plasmavirusproben der neun virämischen Tiere, denen GS-CA1 verabreicht wurde, produzierten 34 von 35 (97 %) qualitativ hochwertige Sequenz-Reads, wobei am Ende der Studie in allen neun Tieren Wildtyp-Capsid nachgewiesen wurde.Das Tier K342 in der Gruppe mit niedriger Dosis (150 mg kg-1 GS-CA1) zeigte zwischen den Studienwochen eine vorübergehende Prävalenz einer Kapsidvariante mit Substitution zu Alanin an Val11 (V11A; die hier verwendete Nummerierung folgt der HIV-1-HXB2-Referenzsequenz). 13 und 21. Diese V11A-Substitution, die sich weit außerhalb der GS-CA1-Bindungsstelle im Kapsid befindet, verschwand in diesem Tier in Woche 22 und ist nicht mit GS-CA1-Resistenz assoziiert4.Somit zeigte kein Versuchstier während der Dauer dieser 24-wöchigen Wirksamkeitsstudie das Auftreten von Varianten, die mit GS-CA1-Resistenz assoziiert sind.PrEP-Schemata mit Langzeitwirkung könnten einige der derzeitigen Hindernisse für die PrEP-Implementierung überwinden, einschließlich der Notwendigkeit einer täglichen Verabreichung und häufiger Interaktionen mit dem Gesundheitswesen.Die HPTN 083-Studie zeigte kürzlich, dass langwirksame ARV-Monotherapeutika wie CAB-LA die HIV-1-Akquisitionsrate wirksam reduzieren können14.In der vorliegenden Studie untersuchten wir, ob eine einmalige Verabreichung des Kapsidinhibitors GS-CA1 bei Rhesusaffen einen langfristigen Schutz vor wiederholten SHIV-Herausforderungen bieten könnte.GS-CA1 bot nach 15 wiederholten Herausforderungen einen signifikanten Schutz vor rektalen Infektionen, wobei ein vollständiger Schutz erreicht wurde, wenn die GS-CA1-Spiegel mehr als doppelt so hoch waren wie die Rhesus-paEC95.Angesichts der ähnlichen strukturellen, mechanistischen und lang anhaltenden Eigenschaften von GS-CA1 und LEN können die präklinischen GS-CA1-Daten in dieser Studie die klinische Entwicklung von LEN für PrEP beeinflussen.Unsere Daten zeigen einen Schutz vor rektaler SHIV-Akquisition bei Makaken bei Plasma-GS-CA1-Expositionen von mehr als dem Doppelten des Rhesus-paEC95, was darauf hindeutet, dass die aktuelle klinische Formulierung von LEN eine mittlere Exposition von mehr als dem Sechsfachen des humanen paEC95 für mindestens 6 Monate danach verleiht eine einzelne subkutane Dosis, könnte für die PrEP beim Menschen ausreichend sein.Dennoch kann die Expositionsschwelle für die Prophylaxe gegen eine HIV-Akquisition mit LEN beim Menschen nicht direkt aus dieser präklinischen Studie mit eskalierender Dosis abgeleitet werden und muss in angemessen fundierten klinischen Studien definiert werden.Darüber hinaus können Tierversuche die zum Schutz erforderlichen Expositionen unterschätzen, wie aus den 4 von 12 inzidenten Infektionen unter 2.243 analysierten Teilnehmern der HPTN 083-Studie hervorgeht, die auftraten, obwohl die Ziel-CAB-LA-Exposition präklinisch als wirksam vorhergesagt wurde19,20.In zukünftigen Arbeiten wird es wichtig sein, die Wirksamkeit von langwirksamen Kapsidinhibitoren über andere Übertragungswege (z. B. vaginal) zu bewerten, um eine breitere Relevanz für die Risikopopulationen festzustellen.Darüber hinaus könnte eine Studie, die Schleimhautbiopsien beinhaltet, die pharmakokinetische Beziehung zwischen Plasma- und Gewebespiegeln von GS-CA1 an den Infektionsstellen aufzeigen.Das Auftreten von Resistenzmutationen kann eine wichtige Überlegung bei der Umsetzung einer langwirksamen PrEP-Strategie mit einem Einzelwirkstoff sein.In der Phase-3-Studie HPTN 083 traten 16 HIV-Serokonversionen bei Teilnehmern auf, die randomisiert CAB-LA zugeteilt wurden, einschließlich 4 Infektionen zu Studienbeginn20.Die Genotypisierung in 14 dieser 16 Fälle ergab Integrase-Mutationen bei 5 Teilnehmern, obwohl keine Resistenz bei Infektionen beobachtet wurde, die vermutlich während des pharmakokinetischen Schwanzes aufgetreten sind.Unsere präklinische Studie zeigte bei neun Rhesusaffen, die mit GS-CA1 behandelt wurden und sich infizierten, keine Resistenzmutationen im Kapsidprotein.Allerdings wurde die Low-Level-Resistenzmutation Q67H im Kapsid (die eine sechsfache Abnahme der Empfindlichkeit gegenüber LEN16 verleiht) in einer kürzlich durchgeführten Phase-1b-Studie bei 2 von 29 Teilnehmern nachgewiesen, die für eine langwirksame LEN-Monotherapie randomisiert wurden21.Diese Mutation wurde 9 Tage nach der Dosisverabreichung bei mindestens einem Studienteilnehmer in zwei der LEN-Behandlungsarme unter den insgesamt fünf Studienteilnehmern nachgewiesen, die die niedrigsten Dosen (20 mg und 50 mg) erhielten, als die durchschnittlichen LEN-Plasmakonzentrationen das 0,7- und 1,1-Fache der Humanwerte betrugen paEC95;beide Konzentrationen gelten als subtherapeutisch für die Behandlung von HIV-1.Diese Daten deuten darauf hin, dass wahrscheinlich große klinische Studien erforderlich sein werden, um das potenzielle Auftreten von Resistenzmutationen bei lang wirksamen PrEP-Empfängern vollständig zu charakterisieren.Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass eine einzelne subkutane Verabreichung des Kapsidinhibitors GS-CA1 einen langfristigen Schutz vor einer SHIV-Infektion bei Rhesusaffen bietet.Zusammen mit neueren Studien, die die Potenz und Pharmakokinetik von LEN bei Menschen mit HIV zeigen, deuten diese Daten darauf hin, dass langwirksame Kapsidinhibitoren eine wichtige und neue Strategie zur HIV-Prävention bieten könnten.Daher wurde eine klinische Phase-3-Studie zur Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von LEN bei HIV-PrEP initiiert (NCT04925752).GS-CA1 und ein generischer interner Standard für kleine Moleküle, der für Flüssigchromatographie-Experimente in Verbindung mit Massenspektrometrie-Experimenten (LC-MS) verwendet wird, wurden beide bei Gilead Sciences synthetisiert und einer standardmäßigen Qualitätskontrollanalyse unterzogen.Für die Tierdosierungsstudien wurde GS-CA1 in Vehikel (58,03 % PEG 300, 27,1 % Wasser, 6,78 % Ethanol, 6,61 % Poloxamer 188, 1,48 % Natriumhydroxid) mit 300 mg ml–1 gelöst, wodurch ein klares, gelbes– orangefarbene Lösung.Die Lösung wurde bis zur Dosierung bei Umgebungstemperatur vor Licht geschützt gelagert.Eine 500-μl-Suspension aus humanen Hepatozyten (1 × 106 Zellen pro ml) und 0,25 μM [3H]GS-CA1 wurde in Krebs-Henseleit-Puffer (KHB)-Medium hergestellt und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 in doppelten Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen.Als positive Kontrolle wurde Propranolol (1 μM final), eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie von Hepatozyten durch Oxidation und Konjugation effizient metabolisiert wird, verwendet.Als Negativkontrolle wurde parallel eine zellfreie Kontrolle inkubiert.Aliquots (100 μl) wurden nach 0 h, 1 h, 3 h und 6 h entnommen und dann mit 200 μl Quenchlösung gemischt, 10 min auf einen Schüttler gestellt und 60 min bei 3.000 g zentrifugiert.Der Überstand wurde auf eine neue Platte überführt, mit 100 μl Wasser verdünnt und für 10 min auf einen Schüttler gestellt.Die Quantifizierung von [3H]GS-CA1 und seinen Metaboliten wurde durch Radioflusschromatographie unter Verwendung eines PerkinElmer Radiomatic 625TR-Flussszintillationsanalysators mit einer 500-μl-Flusszelle, gekoppelt an ein Dionex Ultimate 3000-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie(HPLC)-System, durchgeführt.Als Szintillationscocktail wurde PerkinElmer Ultima-Flo verwendet, der im Verhältnis 1:1 mit dem HPLC-Ablauf gemischt wurde.Die Probe (100 μl) wurde unter Verwendung eines Leap Technologies CTC PAL-Autosamplers injiziert.Die Trennung wurde auf einer Phenomenex Synergi Fusion-RP 80-Å-Porengröße, 4-μm-Partikelgröße, 150 × 4,6-mm-Säule erreicht, die bei 32°C gehalten wurde.Die mobile Phase A bestand aus 95 % Wasser, 5 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA).Die mobile Phase B bestand aus 95 % Acetonitril, 5 % Wasser und 0,1 % TFA.Die Elution wurde bei einer Flussrate von 1 ml min−1 durch lineare Gradienten erreicht: Die Anfangsbedingung war 2 % B bei 0 min, die über 45 min auf 75 % B erhöht wurde, 4 min bei 75 % B gehalten und dann zurückgeführt wurde zu den Anfangsbedingungen.Zwischen den Injektionen ließ man die Säule 12 min lang wieder äquilibrieren.Die Quantifizierung basierte auf der radiochromatographischen Peakfläche unter Verwendung der Software Dionex (Thermo Scientific) Chromeleon 6.8.Frisch isolierte PBMCs von drei männlichen Rhesusaffen (M. mulatta)-Spendern indischer Herkunft (HumanCells Biosciences) wurden in RPMI-1640-Zellkulturmedium (Life Technologies) kultiviert, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS (Hyclone), 2 mM Glutamin und ergänzt war 100 E ml−1 Penicillin plus 100 μg ml−1 Streptomycin (komplettes RPMI).Vor ihrer Verwendung in den antiviralen Assays wurden Rhesus-PBMCs von drei unabhängigen Spendern gepoolt und bei einer Dichte von 3 × 106 Zellen pro ml für 72 h bei 37 °C durch Zugabe von 1 μg ml–1 Phytohämagglutinin (PHA, Sigma- Aldrich) und 50 U ml-1 rekombinantes humanes Interleukin-2 (IL-2) (Roche Diagnostics).PHA/IL-2-stimulierte Rhesus-PBMCs wurden in Massenkultur mit SHIV-SF162P3 bei einer Konzentration von 130 pg p27-Äquivalent pro Million PBMCs infiziert.Die Zellen wurden in Suspension gehalten, indem die mit Virusinokulum vermischten Kulturen 3 h lang bei 37°C vorsichtig geschüttelt wurden.Die Zellen wurden dann durch 5-minütige Zentrifugation bei 500 g pelletiert, zweimal mit vollständigem RPMI gewaschen, um nicht adsorbiertes Virus zu entfernen, und in Platten mit 96 Vertiefungen mit einer Zelldichte von 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung in 100 &mgr;l ausgesät.Acht-Punkt-Dreifach-Reihenverdünnungen von GS-CA1 wurden in vollständigem RPMI hergestellt, das 50 E ml –1 IL-2 enthielt, und wurden in dreifacher Ausfertigung zu Vertiefungen gegeben, die Zellen enthielten (100 &mgr;l pro Vertiefung).Die Kulturen wurden in einem Inkubator mit 5 % CO 2 bei 37 °C für 7 Tage inkubiert.Von den PBMC-Kulturen stammende zellfreie Überstände wurden 7 Tage nach der Infektion geerntet, die Menge an vorhandenem SHIV wurde unter Verwendung eines SIV-p27-Antigen-Einfang-ELISA-Tests (5436, Advanced Bioscience Laboratories) quantifiziert, der gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt wurde, und die Daten wurden erworben mit SoftMax Pro 6.3.1 Software (Molecular Devices).Der mittlere EC50-Wert für GS-CA1, der aus insgesamt sieben dreifach durchgeführten Assays bestimmt wurde, wurde anhand der Dosis-Wirkungs-Kurven mit der Software XLfit 5.5.0.5 (IDBS) berechnet und mit der Software GraphPad Prism 8.1.2 grafisch ausgedrückt .Der Hill-Koeffizient (n) für GS-CA1 wurde aus der Steigung der Dosis-Wirkungs-Kurven (n = 3,03 ± 0,69) gemessen und wurde verwendet, um den EC95-Wert unter Verwendung der folgenden Gleichung abzuleiten: EC95 = EC50 × (95/5) 1/n.Die Rhesus-Plasmaproteinbindung an GS-CA1 wurde durch kompetitive Gleichgewichtsdialyse bestimmt.Rhesusplasma (10 %) wurde mit GS-CA1 (2 μM) versetzt, und diese Mischung und leeres RPMI-Zellkulturmedium, das 10 % FBS (CCM) enthielt, wurden auf gegenüberliegende Seiten von zusammengesetzten Dialysezellen gegeben;danach wurden Inkubationen dreifach durchgeführt.Nach einer 24-stündigen Äquilibrierungsperiode bei 37 °C wurden die Proben mit 4 Volumina 90 % (Vol/Vol) Acetonitril und 10 % (Vol/Vol) Methanol mit internem Standard gequencht.Dann wurden sie mit dem AB Sciex API 4000 LC-MS/MS-System (GenTech Scientific) mit Elektrospray-Ionisation im positiven Modus und Mehrfachreaktionsüberwachung quantifiziert und mit der Analyst 1.6.1-Software analysiert.Der fold change-Wert in 100 % Rhesusplasma wurde dann unter Verwendung des Plasma/CCM-Verhältnisses nach Korrektur des Probenverdünnungsfaktors und des Prozentsatzes der freien Fraktion in der Matrix berechnet.Dieser Verschiebungswert wurde mit dem berechneten Anti-SHIV-EC95-Wert für GS-CA1 multipliziert, um den entsprechenden Rhesusplasma-paEC95 abzuleiten.Studien zur Bewertung der GS-CA1-Pharmakokinetik bei naiven männlichen Rhesusaffen indischer Herkunft wurden in den Covance Laboratories in einer von Laboratory Animal Care akkreditierten Einrichtung unter strikter Einhaltung aller relevanten ethischen Vorschriften durchgeführt.Alle Studienprotokolle wurden vom Covance Laboratories Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) überprüft und genehmigt.Am Tag 0 der Studie wurde Rhesusaffen GS-CA1 in einer Dosis von 100 mg kg–1 (n = 2) oder 300 mg kg–1 (n = 3) in die Schulterblattregion durch subkutane Injektion unter Verwendung einer mit a ausgestatteten Spritze verabreicht 22-Gauge-Nadel.Das GS-CA1 wurde in einer Stammlösung von 300 mg ml-1 hergestellt;maximal 2 ml der Lösung wurden in eine einzige subkutane Stelle injiziert.Von jedem Tier wurde zu bestimmten Zeitpunkten Vollblut entnommen, zu Plasma verarbeitet und dann für die Bioanalyse der GS-CA1-Spiegel bei –80 °C eingefroren gelagert.Für die Provokationsstudie wurden 24 ausgezüchtete Rhesusaffen indischer Herkunft den drei Studiengruppen mit gleichmäßiger Geschlechts- und Gewichtsverteilung zugeteilt.Alle Tiere wurden in Alpha Genesis (Yemassee, SC) untergebracht, und alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit allen relevanten lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften durchgeführt und von der Alpha Genesis IACUC genehmigt.In Woche 0 wurde den drei Gruppen Vehikelkontrolle verabreicht, GS-CA1 dosiert mit 300 mg kg –1 oder GS-CA1 dosiert mit 150 mg kg –1 in der Schulterblattregion durch subkutane Injektion unter Verwendung einer Spritze, die mit einer 22-Gauge-Nadel ausgestattet war .Das GS-CA1 wurde in einer Stammlösung von 300 mg ml-1 hergestellt;maximal 2 ml Lösung wurden in eine einzelne subkutane Stelle injiziert.Die Injektionsstellen wurden 3 Tage lang täglich von tierärztlichem Personal überwacht.Beginnend in Woche 1 wurden die Tiere in allen drei Gruppen intrarektal mit 1 ml RPMI, das die angegebene Verdünnung einer 3,62 × 103 TCID50 SHIV-SF162P3-Stammlösung enthielt, herausgefordert.Zu jedem jeweiligen Zeitpunkt wurden die Provokationen am selben Tag durchgeführt, wobei für alle drei Gruppen derselbe Virusstamm und dieselbe Impfmethode verwendet wurden.Vollblut wurde entnommen und nach Bedarf zu Plasma und PBMCs verarbeitet, um routinemäßige Hämatologie, klinische Chemie, Viruslast und Serologie sowie für die Bioanalyse von Arzneimittelspiegeln zu beurteilen.Die Tiere wurden als geschützt angesehen, wenn sie während der 15-wöchigen Challenge-Phase und der 9-wöchigen Nachbeobachtung im Plasma-PCR-Assay SHIV-negativ und im Enzymimmunoassay seronegativ blieben.Rhesusplasmaproben wurden gefroren bei –80 °C gelagert.Für die Analyse wurden die Proben aufgetaut und ein 50-&mgr;l-Aliquot jeder Probe wurde mit 200 &mgr;l Acetonitril behandelt, das einen generischen internen niedermolekularen Standard enthielt.Nach Ausfällung der Proteinkomponente wurde ein 100-&mgr;l-Aliquot des Überstands auf eine saubere Platte mit 96 Vertiefungen überführt und mit 200 &mgr;l Wasser gemischt.Ein 20-&mgr;l-Aliquot der obigen Lösung wurde dann in ein hochauflösendes Q-Exactive-Massenspektrometer (Thermo Scientific) mit Elektrospray-Ionisierung im positiven Modus injiziert.Die Quantifizierung wurde mit einem Thermo Scientific Xcalibur 4.0.27.19 unter Verwendung genauer Massen (<5 Teile pro Million Massenfehler; [M + H]+ von 958,1853 für GC-CA1 bzw. 758,3270 für den internen Standard) durchgeführt22,23.Die unteren und oberen Quantifizierungsgrenzen für GS-CA1 waren 1 nM bzw. 10.000 nM.Wissenschaft.akt.Meinung.Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google 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